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原代细胞的复苏步骤

来源:admin  浏览量:  发布时间:2019-04-04 10:45:50

  细胞一般储存在液氮中,温度达-196℃,理论上储存时间是无限的。细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快融,实验证明这样可以最大限度的保存细胞活力。

  细胞复苏就是要把原本冷冻保存(冻存)着的细胞恢复到一般的生长状态,今天我们来看看原代细胞的复苏步骤。

  一、检查

  收到细胞株包裹时,请检查细胞株冷冻管是否有解冻情形,若有请立即处理告诉寄方。细胞株请尽速开始培养,或立即冷冻保存(置于–70 °C,隔夜后,移到liq N2)。

  二、冷冻细胞解冻

  1、依据细胞株说明书指定的基础培养基种类、血清种类和其它指定之成份和比例,制备培养基。

  绝大多数之细胞均无法立即适应不同基础培养基或不同的血清种类,若因实验需要,必须有所不同时,务必以缓慢比例渐次改变培养基组成,确定细胞适应后,方进行所需之实验。

  2、 FBS (fetal bovine serum, 胎牛血清), CS (calfserum, 小牛血清)和HS (horseserum, 马血清),对细胞而言差异极大,请务必依据细胞株资料指定的血清种类培养细胞。

  3、将培养基置于37 °C 水槽中回温,回温后喷以70 % 酒精并擦拭之,移入无菌操作台内。取出冷冻管,立即放入37 °C 水槽中快速解冻,水面高度不可接近或高过冷冻管之盖沿,否则易发生污染。轻摇冷冻管使其在1 分钟内全部融化后,以70 % ethanol 擦拭冷冻管外部,移入无菌操作台内。

  4、依据细胞种类和浓度,于无菌操作台内取10 ml 培养基加至T25 或T75 flask中。取出已解冻之细胞悬浮液,缓缓加入T25 或T75 flask 内之培养基,混合均匀,放入37 °C,5 % CO2 培养箱培养。

  5、对绝大多数细胞而言,1 % 以下之冷冻保护剂DMSO,不会对细胞之贴附或活化有不良影响,不需立刻由解冻细胞中去除,待第二天确定细胞生长或贴附良好后再去除即可。

  对极少数因对DMSO 敏感或会造成细胞分化之细胞,需立即去除DMSO 者,则可将解冻后之细胞悬浮液放入5 - 10 ml 培养基中,离心300 xg (约1000 rpm),5 分钟,小心移去上清液,加入适量新鲜培养基,将细胞均匀混合后,转移至培养瓶中,再放入37 °C, 5 % CO2 培养箱培养。

  三、收到T25 flask 细胞时的处理方式

  1. 于寄送过程中,为避免起泡造成细胞脱落死亡,T25 flask 均加满培养基。请检查flask 外观,并于显微镜下观察细胞生长状况和有无污染现象,若有任何问题,不要打开盖子,请立即通知细胞实验室。

  2. 将原封之T25 flask 静置于37 °C, 5 % CO2 培养箱中,使细胞回温至37 °C,并让运送过程中少数脱落的细胞可再附着生长。

  隔天后,于无菌操作箱内取出flask内之培养基,(取出之培养基可以再使用),仅留约5-10ml 培养基于flask 内,依一般培养方式再将细胞置入培养箱中,或细胞已长满盘,则将细胞做传代培养。

  四,细胞复苏注意事项

  1、整个复苏过程尽量手脚麻利一些,战线拉得太长可能影响复苏效果;

  2、由于“化冰”这一步里冻存管与水温差太大,尤其是液氮里来的冻存管,放到水里可能会造成翻江倒海的既视感,所以可以用镊子夹住冻存管往水里摁,这样即使有炸裂的情况也会有水做缓冲;

  3、取冻存管时要谨防冻伤,尤其是夏天,尽管热也最好穿长袖白大褂,一些不经意的动作可能会把你的小鲜肉“粘”到冰箱门上;

  4、离心这一步也可以在冻存管里的冰融化后直接进行,也就是直接把冻存管离心,离心后弃去原来的冻存液,然后直接加完全培养基重悬细胞,接着把细胞转到培养皿/瓶里培养。这种方法也许不能将DMSO清除得很干净,但是基本影响不大。

  5、 复苏第二天记得去看看细胞,如果状态还不错的话就说明复苏成功。